耐药前列腺癌细胞的单细胞蛋白质组学表征揭示了与形态变化相关的分子特征

这项研究采用...

单细胞蛋白质组学分析前列腺癌耐药细胞异质性。

优化的 cellenONE 方案可分离大型多非整倍体 DRC。

鉴定了三种与大小和功能性状相关的蛋白质组学 DRC 亚型。

揭示了与刚果民主共和国侵袭性相关的关键表面标志物和 TF。

提供有关耐药性、复发和转移风险的目标和见解。

这项研究深入研究了前列腺癌中耐药细胞 （DRC） 的蛋白质组学复杂性，这些细胞以其在治疗耐药性、复发和转移中的关键作用而闻名。利用单细胞蛋白质组学 （SCP） 和优化的高通量数据独立采集 （DIA） 方法，每天通量 60 个样品，我们表征了 DRC 与亲本 PC3 细胞相比的蛋白质组学景观。这种 DIA 方法允许在单细胞水平上进行稳健且可重复的蛋白质定量，平均每个细胞能够鉴定和定量 1300 多种蛋白质。在刚果民主共和国群体中鉴定出不同的蛋白质组学亚簇，与细胞大小的变化密切相关。该研究揭示了新的蛋白质特征，包括对细胞粘附和代谢过程至关重要的蛋白质的调节，以及对癌症进展至关重要的表面蛋白质和转录因子的上调。此外，通过进行单细胞RNA-seq（scRNA-seq）分析，我们确定了6个上调基因和10个下调基因，这些基因在SCP和scRNA-seq平台上的药物处理细胞中持续改变。这些发现强调了 DRC 的异质性及其独特的分子特征，为了解其生物学行为和潜在治疗靶点提供了宝贵的见解。

图形摘要

关键字

.前列腺癌细胞系

.耐药性

.单细胞蛋白质组学

.分子特征

缩写

.AGC（自动增益控制)

.ciRT（校准索引保留时间)

.CPM（每百万次计数)

.DDM（n-十二烷基-ß-D-麦芽糖苷)

.DIA-MS（数据独立采集质谱)

.DRC（耐药细胞)

.FDR（错误发现率)

.IAA（碘乙酰胺)

.KNN（K-最近邻)

.LC-FAIMS-MS（液相色谱与场不对称离子迁移谱质谱)

.LD-PCR（长距离聚合酶链反应)

.LMNG（月桂基麦芽糖新戊二醇)

.PASEF（并行累积-串行分段)

.PCA（主成分分析)

.SCP（单细胞蛋白质组学)

.SPD（每天样本数)

.TCEP（Tris（2-羧乙基）膦)

.TEAB（碳酸氢三乙基铵)

.TIMS（捕获离子迁移谱法)

.UMAP（均匀流形近似和投影)

癌症是一种异质性疾病，其特征是具有不同遗传和表型特征的多种细胞群 （1， 2）。其中，耐药细胞（DRCs）因其与治疗耐药性、疾病复发和转移的关联而受到广泛关注（3， 4）。DRC 的特点是体积大、核型复杂，这有助于它们在治疗压力下的适应性和存活率 （5， 6）。DRC 已在各种癌症类型中被发现，包括乳腺癌、结直肠癌和卵巢癌，它们与不良预后和生存率相关 （7-12）。这些细胞通常是由于致癌和治疗应激而产生的，导致基因组不稳定以及形成具有多个细胞核和增大尺寸的细胞 （13， 14）。单细胞技术的最新进展使得这些稀有细胞群能够进行详细的分子表征 （11）。虽然单细胞 RNA-seq （scRNA-seq） 为 DRC 的转录景观提供了宝贵的见解，但蛋白质组学通过直接测量驱动细胞行为的功能性蛋白质分子提供了一种补充方法 （15， 16）。因此，本研究重点关注单细胞水平前列腺癌细胞DRCs的蛋白质组学表征，旨在揭示支撑其独特生物学特性的蛋白质组学改变。

单细胞蛋白质组学，特别是当与数据独立采集质谱 （DIA-MS） （17） 和液相色谱与场不对称离子淌度谱质谱 （LC-FAIMS-MS） （18） 等高通量方法相结合时，可以对这些细胞的蛋白质组学景观进行深入分析。通过采用最先进的单细胞蛋白质组学，我们不仅捕获了这些细胞的广泛蛋白质组学库，而且还对这些细胞的单细胞蛋白质组学表征的可重复性和定量能力进行了基准测试。这种基准测试至关重要，因为它确保了数据的可靠性，尤其是在比较不同细胞群（如 DRC 及其亲本细胞系）的复杂蛋白质组时。此外，由于其大小，分离 DRC 带来了重大挑战 （19， 20）。在这项研究中，我们使用cellenONE仪器进行细胞分离，通过过滤器稀释和渗透细胞来解决与大小相关的问题，以确保准确采样。这项研究标志着首次在单细胞水平上对 DRC 进行详细的分子表征，为其生物学和潜在的治疗脆弱性提供了新的见解。通过将这些发现与 scRNA-seq 相结合，我们的目标是为不断增长的 DRC 知识体系做出贡献，并强调单细胞蛋白质组学在推进临床癌症研究方面的潜力。我们的工作强调了研究这些神秘细胞以开发更有效的前列腺癌治疗策略的重要性

方法

细胞培养和耐药细胞诱导

使用 PC3-荧光素酶-GFP 前列腺癌细胞系（ATCC 并由 UMich 细胞系核心和 JHU 的 Pienta 小组编辑）进行细胞培养实验 （5， 17， 21–24）。将细胞在含有 L-谷氨酰胺和酚红 （Gibco） 的 RPMI 1640 培养基中培养，并补充 10% 优质胎牛血清 （Avantor Seradigm） 和 1% 青霉素-链霉素 （5000 U/ml;Gibco），并在 5% CO2 培养箱中保持在 37°C。Genetica 每两年对 PC3 细胞进行一次鉴定和支原体污染测试。以每 500cm2 培养皿 6,000,000 个细胞的密度接种细胞（康宁）。接种后 24 小时，用 6 μM （GI50） 顺铂处理细胞，溶解在含有 140 mM NaCl 的 PBS 中，72 小时 （Millipore Sigma）。处理后，用新鲜培养基代替培养基，细胞再培养10天，此时它们被认为是确定的耐药细胞（DRC）。培养基每 4 天刷新一次。不含酚红的 TrypLE Express Enzyme 常规用于细胞解离，并使用细胞刮刀刮板。所有离心均在200×g下进行10分钟。将细胞重悬于 PBS 中进行运输。使用EVOS M7000和EVOS FL Auto显微镜捕获图像（ThermoFisher，图1）。PC3亲本和DRCs立即在冰上运输进行细胞分离。

图1 亲本PC3细胞和耐药细胞（DRCs）的形态学和荧光分析。每列代表从同一培养皿内的不同区域拍摄的一式三份图像。每列的左侧面板显示明场图像，突出显示亲本 PC3 细胞和 DRC 之间细胞形态和大小的差异。右侧面板显示荧光图像，确认一致的 GFP 表达。比例尺 = 400 μm。

用于蛋白质组学和 RNA-Seq 研究的单细胞分离

使用 cellenONE 仪器分离单个细胞，该仪器可以通过评估细胞大小的实时成像对单个细胞进行精确作。首先将PC3亲本细胞在PBS中稀释至200个细胞/μl的浓度，并根据直径为22至25μm的细胞大小范围进行分离。对于大型DRCs的分离，将浓度进一步稀释至约50个细胞/μl，以防止细胞分选过程中堵塞cellenONE系统的细胞分选喷嘴。这种稀释允许分离直径达约102μm的DRC，即使细胞是通过70μm细胞过滤器预过滤的。cellenONE系统配备了一个大尺寸压电点胶毛细管（PDC，Cellenion，P-20-CL），液滴体积为450至600 pL，内部尺寸为∼80 μm。尽管PDC尺寸通常限制了大于80μm的细胞的分离，但DRC固有的弹性使它们能够变形并通过喷嘴，从而促进其分离。这些调整对于处理刚果民主共和国种群的更大规模和异质性至关重要。将每个单个细胞分配到含有 1 μl 预添加裂解缓冲液的 384 孔板的孔中，为后续消化程序做好准备。在分离过程中，捕获所有分离细胞的图像，包括细胞直径和明场强度的测量，以供进一步分析。

用于蛋白质组学分析的单细胞样品制备

分离的细胞经过裂解、蛋白质提取和消化，作为板上样品制备 （25）。简而言之，在细胞分离之前，将 1 μl 裂解缓冲液（包括 0.1% DDM、0.02% LMNG 和 5 mM TCEP 在 100 mM TEAB 缓冲液中）添加到 384 孔板的每个孔中。细胞沉积后，将板以1000×g 短暂离心5分钟。对于酶解步骤，向每个样品中加入 0.5 μl 胰蛋白酶/LysC 混合物（总共 5 ng）。用粘性板密封（LabViva，Cat# 186006336）彻底密封板以防止蒸发，并在 37°C 下用加热盖（Benchmark、H5100-HCT 和 H5100-HL）孵育过夜，以保持稳定的温度并减少蒸发。将所得肽样品酸化并储存在-80°C，直到准备进行LC-MS分析。为了上样到根据制造商说明洗涤和激活的 Evotips 上，首先将肽在 10 μl 0.1% 甲酸中彻底洗涤，然后再转移到 Evotips。

用于光谱库生成的批量样品制备

收集总共 50 万个来自 PC3 亲本系或 DRC 的细胞，并在 5% SDS 中裂解。按照制造商的说明，使用 S-Trap micro（PROTIFI，Fairport，NY）进行蛋白质消化。简而言之，裂解后测定蛋白质浓度，用5 mM TCEP还原100 μg蛋白质，用20 mM IAA烷基化。随后，将 2.5% 磷酸和结合缓冲液（100 mM TEAB 中的 90% 乙醇）添加到混合物中，然后将其加载到放置在 1.7 ml 接收管中的 S-Trap 色谱柱上。用洗涤缓冲液洗涤三次后，用 LysC 和胰蛋白酶消化色谱柱上的结合蛋白过夜。最后，使用10 ng消化的肽进行光谱文库生成。

连续稀释肽样品制备

NCI-7细胞用作参考物质（26）。根据CPTAC方案制备来自NCI-7细胞的肽。简而言之，1 x 10∧通过以 10,000 x g 离心 10 分钟裂解 6 个细胞。提取的蛋白质用8M尿素变性，用10 mM DTT还原，用20 mM IAA烷基化。然后用胰蛋白酶消化蛋白质，并将所得肽在九个稀释点（范围为 400 ng 至 125 pg）上连续稀释。

实验设计和统计原理

为确保重现性和可靠性，在LC-MS分析期间包括技术重复。具体来说，对用于谱库生成的块状肽样品和针对单细胞或亚细胞肽水平的稀释肽样品进行了三次技术重复。在单细胞蛋白质组学研究中，我们总共分析了 144 个单细胞，包括 72 个耐药细胞 （DRC） 和 72 个亲本 PC3 细胞。对于单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，共分析了27个单细胞，包括11个DRCs和16个亲本PC3细胞。scRNA-seq 实验在 JHU 核心设施进行，由于资源原因，分析的细胞数量有限。

使用严格的方法评估统计显着性，以确保结果的可靠性。定量值进行log2转换，如果存在定量值，则鉴定蛋白质组。对于蛋白质定量，如果定量每个实验组中至少 70% 的样品包含有效测量值，则用定量蛋白质过滤蛋白质。然后使用邻居数为 15 的 K 最近邻 （KNN） 算法插补缺失值，以最大限度地减少偏差 （27）。应用显着性阈值为 p 值 <0.05 的双样本 t 检验来鉴定差异表达的蛋白质。这种综合方法确保了生物学和技术重复的数量足以检测不同实验条件下蛋白质组学谱的统计学显着差异。

使用 LC-MS 仪器进行蛋白质组学分析

使用与 Evosep LC 配对的两种不同仪器通过 DIA-MS 进行蛋白质组学分析：timsTOF HT （Bruker） 和 Orbitrap Ascend （Thermo）。稀释后的肽样品在 Evosep 中使用短梯度分离，从而可以使用分析柱（PepSep，8 cm × 100 μm x 3 μm）每天对多达 100 个样品 （SPD） 进行高通量分析。对于 timsTOF 上的捕获离子迁移谱 （TIMS），我们将迁移率范围设置为 0.70 至 1.45 V s/cm2质量范围为 100 至 1700 m/z。使用166 ms的积累时间，当肽量低于50 ng时，可实现高灵敏度检测。此外，碰撞能量设置为 0.60 V s/cm2 时为 20 eV，1.60 V s/cm2 时为 59 eV。对于DIA-PASEF，质量宽度设置为25 Da，范围从338.6 Da到1338.6 Da，每个循环总共有40个质量步长，估计循环时间为1.72 s。对于更高输入量的样品（>50 ng 肽），我们将积累时间缩短至 85 ms，并禁用高灵敏度检测。Orbitrap Ascend 仪器配备场不对称离子迁移谱 （FAIMS），配置补偿电压为 −55 V，质量范围为 380 至 980 m/z，MS2 扫描范围为 145 至 1450 m/z，分辨率为 30,000，自动增益控制 （AGC） 目标为 2.5 × 10E5。对于低输入量样品（<50 ng），采集参数包括35 m/z的隔离窗口，重叠为0.5 m/z（总共产生18个扫描事件）和166 ms的最大进样时间（IT）。对于高输入样本，我们应用了 18 m/z 的较窄隔离窗口，重叠为 0.5 m/z（总共 34 个扫描事件）和 59 ms 的 IT。

在单细胞分析（包括谱库生成）中，使用Orbitrap Ascend与Evosep LC和FAIMS（−55 CV）联用，使用相同的分析柱使用60 SPD的通量分离样品。参数与上述参数保持一致，但质量范围调整为380至780 m/z，分离窗口缩小至25 m/z，扫描事件为16个，以优化蛋白质鉴定和定量。离子在 180 毫秒的 IT 期间积累。

scProteomics 数据分析

使用 timsTOF HT 和 FAIMS-Ascend 进行仪器性能评估的蛋白质组原始数据使用 Spectronaut（18.3 版，FASTA 数据库下载 09/15/2023，UniprotKB 审查，20,426 个条目）和直接 DIA 方法对两个数据集进行基准测试，而从 FAIMS-Ascend 获得的单细胞数据则使用 DIA-NN（1.8.0 版）进行分析，采用基于库的数据库搜索。对于这两种工具，蛋白质N末端的乙酰化（乙酰基[N项]）和蛋氨酸残基的氧化（氧化[M]）都作为可变修饰，每个肽最多允许进行三个可变修饰。在Spectronaut中，前体离子和碎片离子的质量容差设置为动态，允许软件根据数据推断出适当的容差。在Spectronaut和DIA-NN中，肽和蛋白质水平的错误发现率（FDR）均控制在1%。使用 Spectronaut 分别处理来自 timsTOF HT 和 Orbitrap Ascend 的原始数据，以确保准确的肽和蛋白质鉴定。由于两种仪器之间碎裂模式的固有差异——timsTOF HT 使用捕获离子淌度分离 （tims） 和 PASEF-DIA 采集，以及使用 FAIMS-DIA 采集的 Orbitrap Ascend——组合搜索可能会在肽的鉴定和定量中引入偏差或不一致。为了避免这种潜在的干扰，对每个数据集的数据进行了独立搜索。然后分别分析定量结果，并用于两个蛋白质组学平台的比较评价。

用于DIA数据分析的光谱库是使用FragPipe（版本21.1，FASTA数据库下载于2023年9月15日，UniprotKB审查，20,426个条目）和easyPQP（版本0.1.50）生成的。处理来自 PC3 亲本细胞和 DRC 细胞的散装肽样品以生成光谱文库。前驱体质量容差和片段质量容差设置为20 ppm。错过的卵沟数设置为 1。固定和可变修改与下游工具中使用的修改一致。以校准索引保留时间（ciRT）为参考进行保留时间（RT）校准，生成0.02 Da UniMod注释和15 ppm片段注释的b和y离子谱图。该文库覆盖全面，包含 7095 种前体和 2034 种蛋白质。这些前体和蛋白质是根据高置信度评分和多次重复的一致检测来选择的。所得文库用于使用DIA-NN对单细胞数据进行基于文库的数据库检索。在DIA-NN中，MS1和MS2精度均设置为10 ppm，扫描窗口为3。启用了同位素、运行间匹配和不相关运行等功能，同时禁用了交叉归一化。使用Perseus（Ver.1.6.15）（28）、BIOMEX（Ver.1.0.15）（29）和String DB进行Reactome Pathway富集分析（Ver.12.0）（30）进行下游数据分析，包括统计学和生物信息学。进行多变量分析，包括主成分分析 （PCA） 和均匀流形近似和投影 （UMAP），以评估总体蛋白质组变异性并确定聚类模式。进行相关性和生物信息学分析，以研究细胞体积与蛋白质组丰度之间的关系。

转录组学分析

裂解缓冲液中来自单细胞的 RNA 立即进行逆转录处理。使用安捷伦生物分析仪（安捷伦技术）评估 RNA 质量。使用 SMART-Seq v4 寡核苷酸技术进行 mRNA 逆转录，该技术采用寡核苷酸 （dT） 引发合成全长 cDNA。反应在42°C下进行90分钟，然后在70°C下进行酶灭活10分钟。优化了第一链cDNA合成，加入了锁定核酸（LNA），以提高模板转换效率。使用长距离 PCR （LD-PCR） 和 SeqAmp DNA 聚合酶进行第一链 cDNA 的扩增。根据RNA输入调整PCR循环数，10 pg RNA使用17个循环。然后使用 AMPure XP 磁珠 （Beckman Coulter） 纯化扩增的 cDNA。使用 Qubit dsDNA HS 检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific）对 cDNA 进行定量，并使用 Agilent Bioanalyzer 评估质量，以确认是否存在高质量的全长 cDNA。对于测序，使用 Takara Bio 的 SMART-Seq 文库制备试剂盒制备 cDNA 文库，该试剂盒利用茎环接头进行酶促片段化和索引。根据输入的 cDNA 浓度，通过额外的 12 至 16 个 PCR 循环进一步扩增文库。扩增后，将样品合并，用 AMPure XP 磁珠纯化，并使用 Agilent 生物分析仪验证文库大小分布。在Illumina平台上测序之前，通过qPCR进行文库定量，利用配对端150 bp读数。

序列比对和基因表达定量

采用FastQC（v0.12.1）工具评估原始测序数据的质量。测序数据的质量显示出高质量的指标，大多数读数在所有碱基的 Phred 质量得分均高于 30。碱基序列质量、GC含量、接头污染等关键质量指标均在可接受范围内，表明测序数据质量良好。然后按照标准管道 （31） 使用 STAR （2.7.11 b） 对齐器将双端测序读数映射到参考基因组。为了获得准确、高速的读取计数量化，基于GRCm39.111 GTF注释数据（32），使用了Subread包（v2.0.6）中的featureCounts函数。从Ensemble数据库下载人类参考基因组（GRCh38）和基因注释（GRCh38.111）GTF数据。为了减少低表达基因的噪声，然后过滤样本中CPM值小于1的基因，留下25,651个基因供后续分析。在此过滤步骤之后，仅保留具有可靠表达模式的基因以供进一步分析。与我们对SCP数据的分析类似，定量值是log2转换的。如果存在定量值，则认为蛋白质组已鉴定，如果每组中至少 70% 的样品包含有效的定量测量值，则认为蛋白质组已定量。为了比较SCP和scRNA-seq数据，使用宽度调整对两个数据集进行归一化，将所有定量蛋白质组的中位数对齐为零。使用p值阈值为<0.05的t检验进行统计分析。

结果

DIA-MS在两种蛋白质组学平台单细胞水平肽蛋白质组学分析中的分析性能评价

在我们的研究中，我们最初使用两种不同的蛋白质组学平台评估了从连续稀释的肽样品中鉴定和定量的蛋白质：一个平台由 Orbitrap Ascend 执行，第二个平台在 timsTOF HT 上执行。Ascend利用FAIMS，根据离子在振荡电场中的差分迁移率选择性地过滤离子。这种选择性离子通道显着降低了化学噪声并提高了信噪比，这对于检测低输入样品中的低丰度肽至关重要，例如单细胞蛋白质组学中的典型肽 （18）。相反，timsTOF HT 采用 PASEF-DIA，结合 Tims 和飞行时间 （TOF） 质谱。timsTOF 可有效实现离子 （Tims） 的积累并提高仪器速度和通量 （TOF） （33）。此外，Ascend还具有自动增益控制（AGC）功能，优化进入质谱仪的离子计数，以确保信号稳定一致。相比之下，timsTOF HT使用离子淌度进行灵敏和高速分析。然而，两个蛋白质组学平台都显示出相当的结果，如图2所示，A-C，在timsTOF上，蛋白质组学平台在高输入肽量（≥50 ng）下鉴定和定量蛋白质数量增加，在FAIMS-Orbitrap Ascend上，蛋白质组学平台在低样品输入下鉴定和定量蛋白质数量增加（补充表S1和S2).根据我们的评估，我们决定使用 FAIMS-DIA 上的蛋白质组学平台进行进一步的单细胞分析。

图2 DIA-MS在两个蛋白质组学平台下单细胞水平肽蛋白质组学分析的分析性能。A、从连续稀释的NCI-7肽样品中鉴定出肽和蛋白组。在此图中，红色表示来自在 Orbitrap Ascend 设置下执行的蛋白质组学平台的 FAIMS-DIA-MS 数据，蓝色表示在 timsTOF HT 设置下执行的 DIA-PASEF 数据蛋白质组学平台。B、使用两个平台进行定量的线性。每个箱线图显示了样品中蛋白质组的 Log2 倍变化平均值与 1 ng 样品中蛋白质组的分布。X 轴显示了我们可以预期的理论 Log2 倍变。C，来自两个不同蛋白质组学平台的每个数据集的每个样本的可重复性。

亲本 PC3 细胞和 DRC 之间蛋白质组丰度和细胞体积的比较

鉴于DRC的尺寸较大，传统的单细胞分离方法被证明具有挑战性。最初，我们使用了推荐细胞稀释度为 200 个细胞/μl 的 cellenONE 仪器，但经常发现它在细胞分选过程中导致喷嘴堵塞。为了解决这个问题，我们实施了两项修改：1）将稀释度增加到50个细胞/μl，以减少喷嘴处的细胞充血，并为细胞发生形态变化留出更多空间;2） 使用过滤器过滤掉聚集在一起的细胞以及使用 cellenONE 在细胞分选过程中导致喷嘴堵塞的极大细胞。尽管在DRCs研究中消除大细胞并不是必需的，但这种调整使我们能够继续处理大DRC细胞，而不会出现问题。

对细胞大小分布的进一步分析显示 DRC 和亲本 PC3 细胞之间存在显着差异。发现亲本PC3细胞的直径范围为22至25μm，而DRC的直径在45至102μm之间变化，这表明DRCs中与多非整倍体相关的显着形态变化（图3A）。蛋白质组学分析显示，每个亲本PC3细胞平均有1174个蛋白组，每个DRC细胞平均有1367个蛋白组，在两种细胞类型中总共鉴定出1567个独特的蛋白质（图3B，补充表S3）。总蛋白丰度的定量显示，与亲本细胞相比，DRCs 中的总蛋白丰度水平显着更高（图 3C），这与 DRC 中观察到的细胞体积增加相关。这表明 DRC 具有更高的代谢和生物合成能力，以支持其更大的尺寸和基因组含量。在DRCs中发现细胞体积与总蛋白丰度之间存在很强的正相关关系（Pearson相关系数为0.69），表明较大的DRC具有更大的蛋白质组学能力（图3D）。这种关系强调了细胞大小对这些细胞功能能力的影响，强调了在多非整倍体细胞的蛋白质组学研究中考虑细胞体积的重要性。

图3 亲本 PC3 细胞和 PC3-DRC 之间蛋白质组丰度和细胞体积的比较。A、细胞径分布。B，每个细胞鉴定的蛋白质组。C，每个细胞的总蛋白质丰度。D、细胞体积之间的相关性（单位：μm3）和蛋白质组丰度。

单细胞蛋白质组的多维分析揭示了前列腺癌 DRC 中不同的蛋白质组学景观和亚型多样性

在我们的单细胞蛋白质组学分析中，结合亲本 PC3 细胞和 DRC，我们采用主成分分析 （PCA） 和均匀流形近似和投影 （UMAP） 来探索潜在的蛋白质组学多样性和相似性。PCA结果（图4A）显示两种细胞类型之间存在明显的分离，证实了显着的蛋白质组学差异。这种明确的界限强调了与刚果民主共和国中多非整倍体相关的显着分子改变，这可能导致其生理状态和治疗耐药性的改变。通过UMAP进一步剖析蛋白质组学景观，我们不仅证实了亲本PC3细胞和DRCs之间的明显聚类（图4B），而且还更深入地研究了DRCs群体中的异质性。UMAP 分析辅以 k 均值聚类，辨别了 DRC 内三个不同的子聚类（图 4C，补充表 S4）。

图4 单细胞蛋白质组的多维分析揭示了前列腺癌细胞中不同的蛋白质组学景观和亚型多样性。A，144个单细胞的PCA图。B、UMAP - 主分组。C、UMAP - 使用 K 均值法的 DRC 中的三个子聚类。D、亚群簇与细胞大小关联（单位：μm3).

DRC 的单细胞蛋白质组学分析揭示了耐药细胞群中三个不同的簇——簇 2、簇 3 和簇 4。每个簇都表现出独特的蛋白质组学特征和对 DNA 损伤剂的功能适应，如 Reactome 通路富集分析所揭示的那样（补充表 S5）。第二类显示出与翻译和代谢过程相关的途径的强烈富集。最显着富集的途径包括翻译（37个基因，FDR：3.35e-18）、蛋白质代谢（87个基因，FDR：6.39e-17）和Cap依赖性翻译起始（21个基因，FDR：1.14e-12）。H2BK1、EIF2S1 和 LDHA 等蛋白质显着上调，凸显了该簇依赖增强的蛋白质合成和代谢稳态来维持压力下的细胞完整性。其他富集途径，例如氨基酸和衍生物的代谢（32 个基因，FDR：4.84e-12）和硒氨基酸代谢（19 个基因，FDR：4.38e-11），表明适应性代谢重新布线以维持生物合成需求和存活。簇 3 表现出独特的蛋白质组学特征，其特征是应激反应机制和代谢灵活性。富集途径包括传染病（93 个基因，FDR：4.64e-24）、RNA 代谢（81 个基因，FDR：4.92e-24）和细胞对压力的反应（69 个基因，FDR：6.84e-16）。上调的蛋白质，如 HSP90AB1、PARP1 和 TFRC，反映了该簇管理蛋白质毒性应激和维持代谢适应性的能力。此外，氨基酸和衍生物的代谢（49 个基因，FDR：1.83e-16）和翻译（50 个基因，FDR：4.12e-21）等途径表明该簇具有生物合成和代谢调节能力，以支持治疗压力下的生存和增殖。第 4 簇的特征是高度侵袭性和侵入性表型。富集途径包括RNA代谢（66个基因，FDR：2.92e-21）、细胞对压力的反应（53个基因，FDR：2.26e-12）和蛋白质代谢（103个基因，FDR：2.14e-17）。上调的蛋白质，如 ITGB1、CD47 和 PARP1，表明迁移能力和应激恢复能力增强。该集群的独特之处在于，流感病毒 RNA 转录和复制（23 个基因，FDR：1.46e-11）和流感感染（26 个基因，FDR：7.20e-13）的富集表明与免疫和微环境因素存在潜在相互作用，支持其侵袭行为。每个亚簇代表一个独特的蛋白质组学特征，可能对应于不同程度的恶性肿瘤和对治疗干预的恢复力。此外，最引人注目的是这些亚簇与细胞大小变化的关联（图4D），我们观察到较大的细胞大小对应于不同的蛋白质组学特征。这种相关性表明，细胞大小是细胞复杂性和代谢能力的代表，可能是在 DRC 中观察到的表型和功能异质性的关键决定因素。

单细胞蛋白质组学表征揭示背根神经节中关键调控蛋白的下调表达

在我们详细的单细胞蛋白质组学分析中，我们发现与亲本PC3细胞相比，DRCs中几种蛋白质显着下调，这对于理解与癌症进展和治疗耐药性相关的生理状态改变至关重要（图5，补充表S6）。这些蛋白质，包括 AHCYL1、APLP2、CTNN1D、EIF2B1、LGALS1 和 SGPL1，在维持细胞粘附、蛋白质合成和脂质代谢等细胞功能方面发挥着至关重要的作用，而这些功能在癌细胞中经常受到干扰。AHCYL1（S-腺苷同型半胱氨酸水解酶样蛋白 1）与细胞内同型半胱氨酸水平和甲基化过程的调节有关，影响细胞可塑性和潜在的肿瘤发生 （34）;它的下调可能会破坏这些关键的代谢过程，从而导致 DRC 的侵袭性特征。APLP2（淀粉样蛋白 β 前体样蛋白 2）以其参与突触功能和细胞粘附而闻名 （35），下调时可能会影响细胞间相互作用和迁移动力学，从而可能促进癌细胞分离和转移。CTNN1D（连环蛋白delta-1）是钙粘蛋白-连环蛋白复合物的一部分，在维持细胞粘附方面起着重要作用（36）;水平降低可能导致粘附性下降和转移潜力增加。EIF2B1（真核翻译起始因子 2B）对于蛋白质合成的启动至关重要 （37）;它的减少可能导致蛋白质产量的广泛减少，影响癌细胞的各种生长和生存途径。LGALS1 （Galectin-1） 在细胞-基质相互作用和免疫反应调节中发挥作用 （38）;其下调可能会影响肿瘤免疫逃逸和细胞通讯。SGPL1（鞘氨醇-1-磷酸裂解酶 1）在鞘脂代谢中至关重要，鞘脂代谢在调节细胞死亡和细胞迁移中至关重要 （39）;其水平的改变可能会改变细胞死亡和存活之间的平衡，从而影响疾病进展。这些蛋白质在刚果民主共和国中的集体下调凸显了细胞调节机制的战略性改变，这可能赋予治疗应激下的生存优势或有助于增强转移能力。了解这些蛋白质变化可以为驱动癌细胞适应和存活的复杂分子动力学提供宝贵的见解，突出旨在减轻 DRC 攻击性行为的治疗干预的潜在目标。

图5 耐药前列腺细胞中下调的蛋白质。与亲本 PC3 细胞相比，DRC 中的蛋白质显着下调（t 检验 p 值 <0.05），包括 AHCYL1、APLP2、CTNN1D、EIF2B1、LGALS1 和 SGPL1。

表面蛋白和转录因子水平的升高凸显了DRCs的侵袭性特征

在我们的分析中，我们发现 DRC 中关键的表面质膜蛋白和转录因子显着上调，这可能在促进这些癌细胞的攻击行为和恢复力方面发挥关键作用（补充表 S6）。在表面蛋白（图6A）中，ACTN1（α-肌动蛋白-1）、CD47和FAT1（FAT非典型钙粘蛋白1）显著增加。ACTN1 在细胞运动和结构完整性中起着关键作用 （40），可能会增强 DRC 的迁移和侵袭能力。CD47，通常被称为“不要吃我”信号 （41），可防止免疫细胞吞噬作用，其升高的水平表明 DRC 正在战略性地适应以逃避免疫监视，从而增强它们在循环系统和转移生态位中的存活率。FAT1 参与调节细胞粘附和信号网络 （42， 43）;它的上调可能促进更强大的细胞间相互作用，并可能促进侵袭性结构的形成。

图6 DRCs中蛋白质显著上调（t检验p值<0.05）。A、利用细胞表面蛋白图谱（http://wlab.ethz.ch/cspa/）筛选关键表面质膜蛋白。B、转录因子由列表（49）获取。

此外，鉴定的转录因子水平升高，包括 COPS2、DDX5（DEAD-box 解旋酶 5）、DNMT1（DNA 甲基转移酶 1）、ENO1、SMARCA5 和 SNRPB，凸显了 DRC 内基因表达调控和表观遗传修饰的动态变化（图 6B）。这些因素是各种细胞过程不可或缺的一部分，例如 RNA 加工、染色质重塑和基因沉默。例如，DDX5 对于 RNA 的加工至关重要，影响 mRNA 剪接和核糖体生物发生的各个方面 （44），这对于快速生长的癌细胞中快速蛋白质合成至关重要。DNMT1在维持DNA甲基化模式中的作用对于基因表达的表观遗传调控至关重要（45），这表明其上调可以通过沉默抑癌基因和激活致癌途径来支持异常的癌细胞增殖。

这些蛋白质和因子在 DRC 中的集体上调表明细胞功能存在复杂的重编程，这不仅增强了这些细胞的侵袭性特征，例如侵袭性和免疫逃逸，而且还支持在不利条件下持续生长和生存的强大基础设施。这种适应可能加剧了 DRC 在临床环境中带来的巨大挑战，强调了对可以破坏这些特定分子机制的靶向治疗的需求。

SCP和scRNA-Seq在耐药细胞中的比较

为了进一步了解药物处理细胞的分子变化，我们将单细胞蛋白质组学（SCP）的结果与RNA-seq数据进行了比较（补充表S7和S8）。这项综合分析揭示了两个组学平台上的一致变化，提供了药物处理细胞中基因表达和蛋白质丰度改变的全面视图。我们在SCP和RNA-seq数据集中都确定了6个上调的基因和10个下调的基因（图7），表明药物处理细胞中存在稳健的调控模式。LIMA1、DHRS1、S100A13、EDF1、UBE2H 和 EPN1 在转录组学和蛋白质组学水平上均显示出表达水平增加，表明这些分子在细胞适应耐药性中起着至关重要的作用。值得注意的是，LIMA1（LIM 结构域和肌动蛋白结合蛋白 1）参与肌动蛋白细胞骨架组织，这可能有助于增强耐药细胞的运动性和侵袭性。同样，S100A13与应激反应和细胞外信号传导有关，进一步强调了这些细胞的攻击性。MCM7、MTMR2、HSPE1、MDH1、ASPH、HDGF、ACSL3、CSDE1、ERI3和AHCYL1在两个组学数据集中均显著下调。MCM7 是小染色体维持复合物的成员，在 DNA 复制启动中起着关键作用，其下调可能表明药物处理细胞的复制周期较慢。参与代谢过程的蛋白质，如 MDH1（苹果酸脱氢酶 1）和 ASPH（天冬氨酸-β-羟化酶）的下调可能表明能量产生途径的改变，这可能有助于这些细胞在药物应激下的存活。

图7 单细胞蛋白质组学（SCP）和scRNA-seq数据集中的基因和蛋白质均发生显著改变。箱线图代表在SCP和scRNA-seq分析中常见的显著调控基因/蛋白质，t检验p值<0.05。紫色框对应基因表达数据，而黄色框代表蛋白质表达数据。每个基因/蛋白质对并排显示，说明了耐药细胞系和亲本细胞系之间的转录组和蛋白质组调控之间的一致性。

讨论

本研究的一个重要方面是使用 timsTOF HT 和 FAIMS Orbitrap Ascend 通过 DIA-MS 评估两种不同的单细胞蛋白质组学蛋白质组学蛋白质组学平台。测试了两种蛋白质组学平台在单细胞水平上鉴定和定量蛋白质的能力，并根据灵敏度、重现性和覆盖深度等因素比较了它们的性能。虽然这两种仪器都表现出强大的性能，但我们最终选择了 Orbitrap Ascend 与 FAIMS 联用进行单细胞蛋白质组学分析。该决定是基于该仪器处理低输入样品的卓越能力、增强的信噪比以及对低丰度蛋白质的一致检测。Orbitrap Ascend 的 FAIMS 功能显着降低了化学噪音并改进了肽的检测，使其特别有利于样品输入有限的单细胞蛋白质组学。这种一致性对于识别耐药细胞 （DRC） 群体中不同的蛋白质组学亚簇至关重要，而其他 MS 平台检测这些亚簇可能更具挑战性。

药物诱导的 DRC 和亲本前列腺癌细胞的单细胞蛋白质组学分析显示，与亲本 PC3 细胞相比，DRC 中已鉴定的蛋白质数量和总蛋白丰度均显着增加。细胞体积和蛋白质组丰度之间的强相关性强调了细胞大小对于理解 DRC 的蛋白质组学能力和功能的重要性。较大的 DRC 具有更高的蛋白质含量，可能具有更高的代谢和生物合成活性，有助于它们在治疗压力下的存活和适应性。

无监督聚类分析表明，亲本 PC3 细胞和 DRC 之间存在明显的蛋白质组学差异，DRC 进一步细分为三个亚簇。这种与细胞大小相关的群体内异质性表明，DRC 可能包含具有潜在不同生物学特征的多种亚型。这种与大小相关的多样性可能对理解癌细胞存活、增殖和转移的生物学产生深远的影响，特别是在治疗耐药性的背景下。这些见解不仅强调了单细胞分辨率在研究癌症异质性方面的必要性，而且还强调了先进的蛋白质组学分析如何阐明细胞形态和分子功能之间复杂的相互作用。这种增强的理解可以为更有针对性和更有效的治疗策略铺平道路，这些策略考虑肿瘤细胞群内的分子和形态多样性。了解这些亚簇的具体特征可以为开发旨在利用每种 DRC 亚型独特弱点的靶向疗法提供信息。

我们研究中一个值得注意的观察结果是 scRNA-seq 和 scProteomics 数据集之间的相关性较低 （Pearson r = 0.21），这与之前的报告一致，表明各种生物系统中 mRNA 和蛋白质丰度之间的一致性较弱 （15， 46， 47）。这种差异可归因于复杂的调节机制，这些机制通过基因表达的调节、蛋白质翻译的控制、蛋白质转录后修饰和蛋白质降解来控制，而这些机制在RNA水平上没有被捕获。例如，我们观察到了关键差异，特别是在表面蛋白和转录因子方面。几种质膜蛋白，包括 CD47、ACTN1 和 FAT1，在药物处理的细胞中显示出蛋白质水平升高，但它们的 mRNA 水平在 RNA-seq 数据集中未检测到或弱表达。同样，DDX5、DNMT1 和 SMARCA5 等转录因子在药物处理的细胞中表现出增加的蛋白质丰度，但相应的 mRNA 变化有限。这些发现强调了蛋白质组学在捕获细胞功能状态方面的价值，因为它直接测量驱动细胞行为、治疗耐药性和疾病进展的蛋白质。虽然转录组学分析为基因表达程序提供了宝贵的见解，但蛋白质组学揭示了负责执行细胞功能的实际分子参与者。此外，与scRNA-seq数据（Pearson r = 0.55）相比，scProteomics数据（Pearson r = 0.78）中的方法内相关性显着更高，这表明单细胞蛋白质组学测量在分析细胞功能状态时显示出相当大的一致性。这与先前的研究表明，与转录组学相比，蛋白质组学更准确地反映细胞表型和功能变化 （48） 一致。这些发现凸显了单细胞蛋白质组学在更深入地了解耐药性分子机制方面的独特优势，特别是在仅转录组数据可能不足以捕获功能异质性的情况下。

DRC 中独特分子特征的鉴定可以深入了解将它们与亲本 PC3 细胞区分开来的途径和过程。DRC 中 AHCYL1、APLP2 和 CTNN1D 等下调蛋白质可能表明参与正常细胞功能的途径受到抑制，从而影响细胞粘附和蛋白质合成。相反，上调的表面质膜蛋白（如 ACTN1、CD47 和 FAT1）表明与细胞结构、免疫逃逸和细胞粘附相关的途径增强。此外，COPS2、DDX5 和 DNMT1 等转录因子上调，表明基因表达调控的潜在变化可能驱动 DRC 的独特特征。SCP 和 RNA-seq 数据的整合在蛋白质组学和转录组学水平上为这些变化提供了有力的验证。这些蛋白质组学变化与转录组学数据相结合，表明药物治疗的前列腺癌细胞采用双重生存策略：增加其细胞灵活性和侵袭潜力，同时下调关键的代谢和增殖途径。这种重新编程使它们能够承受治疗压力，并可能解释它们逃避化疗和建立转移的增强能力。针对这些改变的途径，特别是那些参与细胞骨架动力学、免疫逃逸（例如 CD47）和代谢的途径，可能为治疗干预提供新的机会。此外，耐药细胞群中三个不同簇的鉴定凸显了导致治疗耐药性的功能异质性。簇二表现出对翻译和代谢稳定性的依赖，并得到 H2BK1、EIF2S1 和 LDHA 等蛋白质上调的支持，从而能够在应激下维持蛋白质合成和细胞恢复。第三类的特点是强大的应激反应机制和代谢灵活性，HSP90AB1、PARP1 和 TFRC 等蛋白质驱动其适应蛋白质毒性和代谢挑战的能力，确保在不利条件下的生存。相比之下，簇 4 表现出高度侵入性和侵袭性的表型，由 ITGB1、CD47 和 PARP1 等蛋白质驱动，增强迁移能力、免疫逃逸和增殖潜力。这些发现强调了每个集群的不同生存策略，第二集群侧重于翻译稳态，集群 3 优先考虑应激适应，集群 4 驱动侵袭和转移。这项研究强调了针对亚群特异性脆弱性以克服耐药性和改善治疗结果的重要性。

这项研究的结果凸显了单细胞蛋白质组学在提供对癌细胞异质性和复杂性的详细分子见解方面的潜力。通过将这些详细的蛋白质组学见解与先进的单细胞分析技术相结合，我们旨在更好地了解耐药癌细胞行为的分子基础，并开发靶向治疗策略来对抗其侵袭性和耐药性。这项研究是迈向更加个性化和有效的癌症治疗的基础，凸显了单细胞蛋白质组学在癌症研究中的关键作用。