介绍

空间蛋白质组学（Spatial proteomics， SP）已成为研究健康和疾病机制的有力方法，为研究细胞和组织内蛋白质的空间组织提供了前所未有的见解。这一快速发展的领域获得了显著关注，《自然方法》将其评为“2024年年度方法”(1)。超灵敏质谱的最新进展通过结合互补成像和探索性质谱（MS）方法，为强大的多尺度SP铺平了道路（2,3）。例如，我们最近开创了深度视觉蛋白质组学(4)，它结合了全玻片成像、机器学习引导的图像分析、单细胞激光显微切割（LMD）和超灵敏质谱。其他基于质谱的SP方法包括nanoPOTS(5)、SCPro(6)、FAXP(7)或MALDI成像引导的LC-MS分析(8)。这些方法依赖于减少损耗和自动样品处理的LC-MS分析，以及先进的MS灵敏度和吞吐量。为了使LMD后的组织处理自动化，我们最近开发了一种基于cellenONE系统的机器人样品处理方案，该方案每天可以制备数百个组织样品(9)。我们引入了proteoCHIP EVO 96用于LMD后的组织蛋白质组学，从0.04 nL（40000µm3）的人扁桃体组织微区中定量了超过2000个蛋白质，每天进行30- 40次测量。在这里，我们扩展了这些工作，并得出了一个显著改进的方案，以更高效和更大规模的组织处理。我们还系统地比较了所有Evosep ONE Whisper Zoom方法（20、40、80和120 SPD）与timsUltra AIP质谱仪的适用性，以提供高质量的空间组织蛋白质组学。基于为超低输入和高通量组织分析量身定制的优化LC-MS方法，我们证明每天可以制备和测量超过100个空间分辨蛋白质组。我们在一个罕见的口腔癌症中验证了我们的流程，从中我们分析了170个微区域，从而揭示了肿瘤内的蛋白质组异质性。这些结果为空间蛋白质组学研究的设计提供了实用的指导，并为基础和转化研究中队列大小的空间组织蛋白质组学提供了坚实的基础。

结果

高通量空间组织蛋白质组学的简化工作流程

为了大幅提高低输入空间组织蛋白质组学的样品处理和LC-MS采集的通量和灵敏度，我们改进了我们最近开发的cellenONE样品制备工作流程，并评估了其与最新一代timsUltra AIP质谱仪上所有四个Evosep ONE Whisper Zoom梯度相结合的实用性（图1a）。虽然Whisper Zoom LC方法（每天20、40、80和120个样品）旨在平衡样品吞吐量和灵敏度，但timsUltra AIP采用最新的捕获离子迁移技术，结合先进的athena离子处理器（AIP），利用可编程的质量范围传输，优化了片段离子的信息丰富区域（方法）。总之，这种设置显著地提高了深度蛋白质组学分析的灵敏度，并且样本输入最少。

对于样品制备，我们略微修改了之前制定的方案，使其更不受气候条件的影响，因为室温和湿度会影响样品的蒸发。因此，我们在裂解和消化步骤中分别将复水体积从500 nL增加到650 nL和150 nL增加到180 nL，并在消化缓冲液中添加100 mM TEAB和30% ACN。任选地，液体分配器（例如Formulatrix MANTIS）可用于添加缓冲液，以显著加快方案的速度。这些工作流程的改进和基于离心的Evotip加载程序使我们能够将从激光显微解剖到MS采集准备的样品的总处理时间减少到仅2.5小时。我们还改进了最新一代proteoCHIP EVO 96（补充）的LMD适配器。图1a)，并为3D打印提供了一个更新的模板。适配器靠近LMD7显微镜内的组织标本，使用三种不同的组织类型（图1b），对于0.04 nL （40,000 μ m3，即5 μ m厚切片的8,000μm2）的测试组织微区，可实现bbb90 %的高组织收集率。为了对低输入组织蛋白质组学的所有四种Whisper Zoom梯度进行系统评估（图1c），我们选择了两种具有不同动态范围的组织类型。小鼠肝脏FFPE组织是一种较为均匀的组织类型，具有较大的蛋白质丰度动态范围。相比之下，人类扁桃体组织是一个高度结构化的组织，由空间界定的t细胞、b细胞和鳞状上皮细胞区域组成。因此，这种组织类型是评估我们的工作流程量化细胞类型特异性蛋白质组能力的理想方法。对于两种样品类型和所有四种Whisper Zoom方法，我们分析了四卷范围为0.04 nL至0.5 nL的激光显微解剖组织（补充资料）。图1 c)。蛋白质组学结果使用

表1总结了DIA-NN（10）。正如预期的那样，更长的梯度（即20SPD和40SPD）导致两种组织类型的蛋白质组覆盖率更高，从0.5 nL的扁桃体组织中达到7,000-8,000个蛋白质和90,000-100,000个前体的峰值（图1d，补充）。图1 d)。然而，较长的梯度的益处明显取决于组织类型和样本量。例如，使用20 SPD方法，大约6倍的组织采样（0.04 nL对0.25nL）导致蛋白质鉴定增加48%。相比之下，使用120 SPD方法仅多出24%的蛋白质。对于最低测试组织量（0.04 nL），我们注意到短梯度（80 SPD和120SPD）的通量增加通常超过了较长梯度在蛋白质鉴定方面的改进。换句话说，6.6倍长的LC梯度（20 SPD为68分钟，120 SPD为10.3分钟）导致肝脏和扁桃体的蛋白质组覆盖率分别仅增加37%和46%。来自仅0.04nL的肝组织，大约相当于。10-15个肝细胞（11），我们使用WhisperZoom 120 SPD方法定量平均15,545个前体和2,182个蛋白质。这与t细胞富集扁桃体区域的21,580个前体和2,904个蛋白质相比，我们将其归因于它们不同的蛋白质丰度动态范围（图1e）。与我们的第一代工作流程(9)相比，这些数据表明，在相似的蛋白质组深度下，样品通量增加了3倍，或在相似的LC-MS通量下，样品通量增加了2倍的蛋白质组覆盖率（约2,000个蛋白质vs .约4,000个蛋白质）。值得注意的是，无论组织数量和梯度长度如何，所有测量的定量可重复性都很好。对于肝组织，最小（0.04 nL）和最大（0.5 nL）的组织内重复的平均变异系数（CV）分别为14.8%和12.8%（图1f）。对于扁桃体组织，平均cv略高，分别为16.3%和16.0%，这可能反映了更大的组织异质性。这一趋势在肝脏和扁桃体的全球蛋白质组相关性中也很明显，约为0.96，表明高重复性和稳健性（补充）。图1 e)。重要的是，我们量化了许多已知的肝细胞和t细胞特异性标记，包括已知的免疫效应分子（如GZMA）、细胞类型标记（CD3、CD8和CD4）和转录因子（如TCF7和IRF4）（图1g）。值得注意的是，这种深度和细胞类型特异性捕获了所有1779个人类免疫系统过程（GOBP）注释蛋白中的1026个（58%），以及单次20 SPD注射中超过50%的t细胞特异性途径（图1）。

表1：基于四种组织数量和两种组织类型的四种Whisper Zoom方法的蛋白质和前体鉴定。

图1：高通量空间组织蛋白质组学的简化工作流程

(a)空间组织蛋白质组学工作流程概述。(b)不同0.04 nL FFPE组织类型对EVO 96芯片的收集效率。(c)每天在120个（橙色）、80个（粉色）、40个（紫色）和20个（蓝色）样本中测量代表性肝脏（上）和扁桃体（下）样本（0.04 nL）的MS2强度。(d)不同Whisper Zoom梯度下组织样品的蛋白质鉴定。对0.04 nL、0.16 nL、0.25 nL和0.5 nL的体积进行激光显微解剖。给出6 ~ 8次测量的平均值。数据处理没有（蓝色）和（黑色）运行间匹配（MBR）。(e)肝脏和扁桃体组织蛋白质组的累积蛋白质强度（0.25 nL）由高到低排列。饼状图显示了最丰富的前500个蛋白质的累积强度，表示为两种组织的每个样本中总蛋白质强度的百分比。(f)两种组织类型中蛋白质数量的变异系数（CV）分布，分别由120 SPD中0.04 nL样本（橙色）和40 SPD中0.25 nL样本（紫色）表示。平均CV值显示为虚线。(g)肝脏（左）和扁桃体（右）组织蛋白质丰度的动态范围，分别用0.04 nL表示

样品在120 SPD和0.25 nL样品在40 SPD。突出显示了肝细胞和t细胞特异性标志物。对于单一轮廓样本，每4次测量至少需要两个定量值。(h)来自免疫系统和t细胞特异性基因本体论细胞成分（GOCC）的蛋白质鉴定。

用于高通量空间组织蛋白质组学的优化DIA方法

根据我们的观察，120 SPD方法在样品通量和蛋白质组覆盖率之间提供了很好的权衡，我们进一步评估了六种MS方法（图2a，表2），以进一步提高我们增强通量策略的定量性能。6种MS方法分别代表2种diaPASEF-、2种diagonalPASEF-和2种pydiaid -方法，具有不同的积累和斜坡时间（75 MS和100 MS）。与我们的梯度比较相似（图1c-f），我们使用了小鼠肝脏和人类扁桃体的组织微区域，但这次只关注8,000µm2的最小组织区域，提供了约100µm的空间分辨率（中心到中心的距离）。我们的目标是推导出一种优化的LC-MS方法集，以实现高样品吞吐量、空间分辨率和定量鲁棒性，而不需要过多的LMD采样。使用我们的2.5小时cellenONE协议和120 SPD设置，我们在不到一天的时间内完成了整个实验，包括每种MS方法的8个组织内重复。我们进行了两次独立的实验，以增加重复量，并验证了我们的工作流程的可重复性和稳健性。

表2:6种DIA方法结合Whisper Zoom 120 SPD方法的比较。

总的来说，我们发现所选择的MS方法对两种组织中鉴定出的蛋白质数量有显著的影响，在肝脏和扁桃体组织中，最好的方法和最差的方法相比，分别平均增加了37%和29%（图2b-c）。

除了对角线pasef外，较短的积累时间导致蛋白质鉴定显著提高，肝脏中平均有2700个蛋白质，扁桃体组织中平均有2200个蛋白质。供应商标准diaPASEF 3 × 8（方法2）和pyDIAid优化方法（方法6）均具有75 ms积累和斜坡时间的最高识别率。作为一个额外的度量，我们评估了每个峰值的数据点，以评估6种方法的定量性能。更快的对角线pasef（方法4）和pyDIAid优化方法（方法6）具有最高的平均每个峰10-12个数据点（图2d）。考虑到蛋白质组覆盖率和每个峰值的数据点，我们得出结论，方法6，pydiaid优化的窗口设置具有75 ms的积累和斜坡时间，提供了最佳的整体性能。然而，标准的3 × 8 diaPASEF方法（75 ms积累和斜坡时间）表现第二好，也是一个很好的选择。这也反映在肝脏中为0.97和0.96，扁桃体组织复制中为0.94和0.95的高整体蛋白质组相关性上（图2e-f）。这两种方法支持稳健和可靠的蛋白质鉴定，因此非常适合用于高通量应用，以揭示空间组织蛋白质组异质性。

图2：使用pyDIAid优化方法对FFPE组织进行稳健可靠的蛋白质定量。

(a)肝脏和扁桃体FFPE组织基准实验的组织制备策略。在120 SPD下，对0.04 nL的小组织面积进行激光显微解剖和测量，比较六种常用的MS方法。(b)采用不同MS方法测定的肝组织样品的前体和蛋白质鉴定。展示来自两个不同实验的16次测量的平均值。(c)使用不同MS方法测量的富含t细胞的扁桃体组织样品的前体和蛋白质鉴定。展示来自两个单独实验的16次测量的平均值。(d)小提琴图显示了每种MS方法在肝脏（上）和扁桃体（下）组织中每个峰值的数据点分布。覆盖的盒线图显示了中位数（中线）、四分位距（盒）和延伸至1.5 × IQR的晶须。(e)一个实验的方法2和方法6的蛋白质组相关性箱形图（Pearson s r）。

(f)两个代表性样本之间的蛋白质组相关性（Pearson r）。

一种罕见的口腔鳞状细胞癌的组织全蛋白质组分析

基于我们新开发的高通量空间组织蛋白质组学工作流程，我们开始研究一种罕见的、尚未得到充分研究的口腔鳞状细胞癌（SCC）。在IF （panCK, COL1A1， CD3和CD20）和H&E染色后，我们对小roi进行了组织范围的分析，以分析SCC肿瘤内蛋白质组的异质性。在IF和H&E的引导下，我们系统地采样了192个微区（8000µm2）的间质和癌室，分布在直径为2厘米的整个组织切片上（图3a）。为了评估我们的样品制备方案的稳健性，我们在两个单独的cellenONE实验中处理了样品。样品制备和LC-MS分析只用了不到两天的时间，过滤后总共获得了170个高质量的蛋白质组学测量结果（图3b-c）。然而，在使用SCC组织时，我们注意到基于重力的组织收集效率低于我们在肝脏和扁桃体实验中看到的效率，导致一小部分组织轮廓没有最终到达井底，导致蛋白质组质量低。因此，我们在组织溶解之前重新引入了有机溶剂冲洗步骤，以确保最佳的蛋白质组学结果，将样本损失从19%减少到仅4%（图3b，方法）。由于采集效率具有高度的组织和细胞类型特异性，因此我们通常建议使用这样的有机溶剂冲洗以增强一致性。

使用120 SPD方法，我们在癌区和间质区分别平均鉴定出2,812和2,719个蛋白质，总共鉴定出5,453个蛋白质（图3c）。蛋白质组显示出高度的区室特异性，并通过区域特异性细胞组成聚集。值得注意的是，主成分分析（PCA）显示没有可检测的批效应，强调了我们的管道的鲁棒性（图3d）。样本组（肿瘤、基质和免疫浸润）之间1663个ANOVA显著蛋白的无监督分层聚类揭示了不同组织间室的不同表达模式（图3e）。有趣的是，我们发现了一小部分被基质细胞包围的t细胞浸润癌细胞，这表明这些区域表现出独特的表型，具有独特的肿瘤-免疫和肿瘤-基质相互作用（图3a）。它们的蛋白质组与主要肿瘤区域明显不同，并与基质样本紧密分组，表明它们具有更多的间质表型（图3e）。为了进一步了解这种肿瘤疾病中上调的生物学过程，我们对两个主要聚类进行了通路富集分析（图3f）。基质蛋白质组显示了高水平的生物学过程，如PDGF的信号传导，MHC蛋白复合物和层粘连蛋白相互作用。在肿瘤中，最富集的通路包括已知的

癌症生物学的标志性特征，包括蛋白质翻译，泛素蛋白连接酶活性，RNA剪接和DNA修复。为了评估肿瘤内蛋白质组异质性，我们计算了分布在整个组织切片上的140多个样本的蛋白质水平变异性（变异系数，CV）（图3g）。我们在不同的癌症区域中鉴定了数十种具有高蛋白质水平变异性的蛋白质，包括CYC1和ALDH3A1，这表明代谢活性和氧化应激适应的空间差异。值得注意的是，我们鉴定了玉米粒蛋白（CRNN），也被称为鳞状细胞热休克蛋白53，是我们数据集中变异最大的蛋白质。Cornulin被证实在鳞状细胞癌中具有促进癌症的作用（12），并且可能反映了细胞分化的空间差异。粒细胞标记物EPX的高变异性表明该肿瘤的肿瘤免疫微环境存在显著差异。可以肯定的是，对20%差异最大的蛋白进行的通路富集分析发现，免疫系统和固有免疫相关过程与代谢变化一起富集最显著（图3h）。

综上所述，我们的空间解析蛋白质组学数据揭示了与疾病相关的通路，并提名了与高区域特异性表达和肿瘤内异质性相关的蛋白质。

图3：头颈部鳞状细胞癌的组织图谱。

(a)左：5µm厚的鳞状细胞癌组织切片的免疫荧光全玻片图像。红圈为组织采集区域；中间：用于激光显微切割和蛋白质组学分析的注释放大的示例性间质和肿瘤区域；右：t细胞浸润的肿瘤生态位。(b)乙腈洗涤和未洗涤两种实验的高质量蛋白质组数。(c)来自癌症和基质组织样本的蛋白质鉴定。(d) 170个样品经70%有效值过滤后，按条件（左）和批（右）进行主成分分析（PCA）。(e)所有样本中ANOVA显著蛋白的无监督分层聚类（p < 0.05） (f) (e)中ANOVA显著蛋白的基因本体（GO）富集分析。(g)癌症蛋白质组变异系数图。大部分可变蛋白（最高五分位数）用绿色标记。(h)来自(g)的可变蛋白的通路富集分析。

讨论

空间蛋白质组学领域正在快速发展，并受到整合基于成像的细胞表型分型、激光显微切割和基于质谱的探索性蛋白质组学的创新方法的推动(2)。为了促进这些方法的广泛应用，并使其适合于队列规模的蛋白质组分析，提高灵敏度、通量和空间分辨率至关重要。这不仅需要能够高效处理数百个样本的稳健和自动化的样品制备流程，而且还需要平衡LC-MS策略，提供高灵敏度和高通量。在本研究中，我们改进了之前开发的cellenONE组织方案，并在timsUltra AIP质谱仪上系统地评估了基于肝脏和扁桃体FFPE组织的所有Evosep ONE Whisper Zoom梯度（20-120 SPD）。我们证明了短梯度（例如，120 SPD）在超低组织量的通量和蛋白质组学深度之间提供了一个很好的折衷，使得每天可以制备和获取超过100个空间分辨率的蛋白质组测量。我们从低至0.04 nL的ofFFPE组织中定量了3000多种蛋白质，具有出色的定量再现性。一般来说，较长的梯度（例如，20 SPD）与增加的组织采样相结合时，其益处最为明显。例如，在全玻片免疫荧光成像后，我们从每单次20 SPD注射0.5 nL的扁桃体组织中分析了7500多个蛋白质组。值得注意的是，这一深度足以捕获基因组中注释的所有免疫系统过程（GOBP）相关蛋白的一半以上。此外，我们观察到组织类型与梯度长度和组织输入量一样是定义蛋白质组覆盖率的重要因素。与我们的扁桃体结果相反，在使用肝组织时，我们观察到尽管LMD增加了组织采样，但蛋白质鉴定在5,000-6,000个蛋白质左右饱和。这些发现对未来空间蛋白质组学研究的设计具有重要意义。一方面，肝脏等高动态范围组织为具有良好空间分辨率的应用提供了令人兴奋的入口点，例如单细胞应用（13,14），而全蛋白质组测量（如7,000 ~ 10,000个蛋白质）同样具有挑战性，从单次分析实现，可能需要额外的分离方法，如气相分离技术（15），以降低样本的复杂性。这凸显了基于基础组织特性平衡切除的组织面积和解剖轮廓数量的重要性。这些结果提出了一些关于空间蛋白质组学研究设计的基本问题。例如，需要采集多少组织才能最好地解决感兴趣的生物学问题？需要考虑的关键参数是：(1)的动态范围分布

(2)组织内的空间梯度（需要多少生物粒度，在单细胞LMD方法或多细胞区域/生态位之间进行选择），最终形成问题(3)平衡组织切片的数量、轮廓大小和梯度。

我们还比较了三种常见的DIA方案，并推导出一种优化的pyDIAid方法，该方法在有限的组织量下获得了更好的蛋白质组覆盖率和定量性能。我们的分析比较了不同的DIA方法，也强调了优化方法的重要性，特别是针对组织样本，而不是仅仅依赖于细胞培养评估（例如，HeLa肽稀释）。结合我们的Whisper Zoom梯度测试，我们导出了一套优化的方法，每天可用于120个高质量的空间蛋白质组学。我们证明了我们优化的端到端工作流程对一种罕见的口腔鳞状细胞癌进行大规模和全组织蛋白质组分析的可行性。在IF显微镜的指导下，我们分析了170个微区域，揭示了这种研究甚少的癌症的瘤内蛋白质组异质性。我们的结果揭示了与翻译、泛素系统、RNA剪接和DNA修复相关的蛋白质的上调，并鉴定了数十个具有高度瘤内异质性的蛋白质，从而为鳞状细胞癌的未来研究提供了宝贵的资源。

综上所述，本研究为大规模空间组织蛋白质组学研究提供了一个优化的、可扩展的工作流程，为空间发现蛋白质组学的基础和转化研究奠定了坚实的基础。

实验程序

小鼠肝组织收集

所有动物实验均按照英国癌症研究协调委员会（UKCCR）的指导方针进行，并得到当地政府当局的批准(柏林地方政府机构（Landesamt fr Gesundheit und Soziales，批准号G0004/14）。来自Jackson实验室的C57BL/6小鼠被安置在max - delbrck -分子医学中心（柏林）的特定无病原体小鼠设施的单独通风笼子中。切除肝脏时，先将小鼠麻醉后安乐死，取肝脏，用冰冷的PBS洗涤2次，置于4%甲醛溶液中固定24 - 48小时。随后，将肝脏包埋在石蜡中进行进一步的组织学检查。

人体组织收集

采用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）人体组织：一个非肿瘤性腭扁桃体和一个上颌鳞状细胞癌（SCC）标本进行LCMS方法优化实验。这两个样本都是从德国柏林本杰明富兰克林校园柏林慈善病理研究所档案馆获得的。扁桃体标本来自一名复发性扁桃体炎的26岁男性患者。在10%中性福尔马林缓冲液中固定后，对标本进行称重、测量、肉眼检查，并将其切成5 mm的切片。两个代表性切片石蜡包埋。从得到的组织块上切下2mm厚的切片，并用苏木精和伊红（H&E）染色。组织学评估显示淋巴样组织滤泡增生和间质硬化。SCC标本来自一名53岁女性患者。将上颌骨切除标本固定、测量并涂墨标记切缘，然后切成5 mm的切片。在切片中，在距前软组织边缘2 mm的距离处，发现一个40 mm的白灰色、坚硬的肿瘤。代表性的肿瘤区域，包括靠近边缘的区域，被石蜡包埋。切片切开并用H&E染色。组织学和免疫组织化学分析显示p16阴性，中度分化角质化SCC伴骨浸润，局灶性神经周围浸润，无血管浸润，上皮异常增生或淋巴血管浸润。PD-L1的表达定量如下：TC评分15%，IC评分12%，CPS评分27。肿瘤最终分期为pT4a pN2c (2/46) L0 V0 Pn1 G2 R0。

然后将所有组织块在室温下保存在本杰明富兰克林校区慈善大学医院病理研究所的档案室中。这项研究是根据《赫尔辛基宣言》的医学研究伦理原则进行的，并获得了柏林慈善大学医学系伦理委员会的批准（EA1/222/21）。

组织切片，免疫荧光染色和H&E染色

FFPE块在PPS框架载玻片（徕卡，11600294）上以5 μm厚度切片，并在37℃烤箱中过夜。将载玻片在60℃加热30分钟以改善组织黏附和脱蜡。小鼠肝脏标本用H&E染色。人类扁桃体和HNSCC样本通过免疫荧光染色。为了提高抗体的结合能力，我们对样本进行了热诱导的抗原表位检索。总之，将其加热到95℃并保持30分钟，然后使其在室温下冷却30分钟。对于体组织，使用三种靶向CD20（稀释度1:50，赛默飞世尔科学公司，53-0202-80,Alexa Fluor 488）、CD3（稀释度1:100，NovusBio公司，NBP2-52710AF647, Alexa Fluor 647）、泛细胞角蛋白（稀释度1:100，赛默飞世尔科学公司，41-9003-82,eFluor 570）的偶联抗体。对于癌组织，使用四种靶向泛细胞角蛋白、CD20、CD3和COL1A1的偶联抗体（稀释度1:50，NovusBio, NB600-408AF750, Alexa Fluor 750）。在湿度室中在4℃下进行过夜组织染色。抗体用3% BSA （in 1x PBS, Serva, Cat）稀释。11948.01)。抗体孵育后，组织用PBS洗涤四次，并用10分钟的Hoechst处理（1:1000 PBS, Thermo Fisher Scientific, 62249）进行核染色。为了改善激光显微解剖的检查，组织进行了H&E染色。

徕卡LMD7采集板适配器的设计

我们为新版本的proteoCHIP EVO 96设计了一个新的适配器。该适配器由透明丙烯酸玻璃（PMMA-gs）通过数控铣床制作而成。它也可以使用标准3D打印机使用提供的文件(。stl格式)。设计和测量在补充图中描述。3D打印机文件见补充材料。

全幻灯片成像和LMD

使用Zeiss Axioscan对免疫荧光标记的人体组织切片进行成像

7系统，其特点是广角光学，一个Plan-A光色谱仪10x/0.45 M27物镜，

和Alexa荧光染料的四波段滤光片组。然后将这些图像导入QuPath（版本0.5.1）进行进一步注释。一名训练有素的病理学家合作对各个感兴趣的区域进行注释。这些注释，连同用于轮廓对齐的三个参考点，以geojson格式导出，并转换为LMD所需的.xml格式。轮廓被映射到proteoCHIP EVO 96上的特定目标位置。处理这些形状的代码可以在github.com/CosciaLab/Qupath_to_LMD上获取，利用地质田和py-lmd包。LMD采用徕卡LMD7系统，徕卡激光显微解剖软件V进行

8.3.0.08259.使用LMD软件中的通用夹具函数定义定制的钢板布局。根据轮廓大小，在明场模式下使用10倍或20倍的干物镜进行组织切割。

使用cellenONE系统制备样品

为了将组织样品浓缩在proteoChip EVO 96底部，收集后可在每孔中加入10 μL乙腈，室温风干10分钟。在制备蛋白质组学样本前，建议再进行一孔检查，以确保高效采集。对于cellenONE，使用经过净化和过滤的水（bbb18 MΩ， <3 ppb TOC, 25◦C）。使用MANTIS液体分配器（Formulatrix, V3.3 ACC RFID，软件版本4.7.5）将2微升裂解缓冲液(含0.1% n-十二烷基β- d -麦芽糖苷（DDM）， 0.1 M pH为8.5的四乙基溴化铵（TEAB）， 5 mM三（2-羧基乙基）膦（TCEP）和20 mM氯乙酰胺（CAA）分配到每孔中。233128)。对于裂解过程，样品在cellenONE中加热，设置在65℃和85%湿度下操作。连续再水化（650 nL/循环，1000 Hz）以防止裂解缓冲液从井中蒸发。请注意，每个循环分配的体积可能需要根据当地温度和湿度进行调整，以防止完全蒸发。经过60分钟的孵育后，将温度降低到20℃，并继续补液直到温度达到25℃。在25℃时，过程停止，并加入1 μ L混合酶(10 ng/µL裂解酶和胰蛋白酶(Promega, Cat。V5072), 0.1 M TEAB, 30% ACN)使用MANTIS液体分配器进行配药。反应混合物在cellenONE中于37℃、85%湿度下孵育1小时，保持连续复水（200 nL/循环，500 Hz）。

使用C-18尖端进行肽清理

消化后，使用制造商推荐的Evotips （EV2013, Evotip Pure, Evosep）进行肽清理。很快，用20 μL缓冲液B （99.9% ACN, 0.1% FA）冲洗针尖，800 rcf离心1分钟。为达到平衡，每个针尖加入20 μL缓冲液A(99.9%水，0.1% FA)，异丙醇活化10 s， 800 rcf离心1分钟。加入17 μL缓冲液A，将proteoCHIP EVO 96直接翻转到活化的Evotips上。800 rcf离心1 min， Evo96芯片孔用3µL缓冲液A洗涤，重复样品转移步骤。每尖端加入100 μL缓冲液A，在800 rcf下离心10 s，确保液体到达膜上。然后将尖端放置在一个托盘中，托盘上有一个包含缓冲液a的支架，确保尖端保持在水中且没有干燥。

质分析

LC-MS分析在Evosep ONE (Evosep Biosystems) LC系统上进行，该LC系统连接到捕获离子迁移率光谱四极杆飞行时间质谱仪（timsUltra AIP, Bruker Daltonics）。Evosep ONE在Whisper Zoom配置下操作，并与Aurora Rapid 75 （5 cm x 75 μ m x 1.7 μ m, IonOpticks）和Aurora Elite （15 cm x 75 μ m x 1.7 μ m, IonOpticks）一起使用，两者都保持在50°C。缓冲液A由0.1%甲酸在LC-MS级水中组成，缓冲液B由0.1%甲酸在乙腈中组成。

采用Whisper Zoom 20 SPD、40 SPD、80 SPD和120 SPD法分离多肽。洗脱肽在dia-PASEF和对角-PASEF中检测，使用timsUltra AIP质谱仪，配备捕获喷雾Ultra 2离子源，在正离子模式下工作。Whisper Zoom 120 SPD的毛细管电压设置为1300 V， Whisper 40 SPD设置为80 SPD和1500 V，毛细管温度为200℃时设置为20 SPD。所使用的dia-PASEF方法有：1)3 m/z范围，6个MS/MS PASEF循环，固定25个Da窗口，350 - 800 m/z，离子迁移率范围为0.64 - 1.25 1/k0，积累时间为100 MS，周期时间为0.75 s; 2) 3 m/z范围，8个MS/MS PASEF循环，固定25个Da窗口，400 - 1000 m/z，离子迁移率范围为0.64 - 1.45 1/k0，累积时间为100 MS

2) 3 m / z范围；8 ms / ms pasef周期，离子迁移率为0.64 ~ 1.45 1 / k0，累积时间为75 ms，梯度时间为0.74 s；3和4)一个3 m/z范围，5个MS/MS PASEF循环，基于400 - 1000 m/z的离子密度分布，使用pyDIAid（16）在0.64 - 1.45 1/k0的离子迁移率范围内优化，积累时间分别为100 MS或75 MS，周期时间分别为0.64 s和0.49 s；

5和6的对角-PASEF方法的5个不重叠的MS/MS PASEF周期与切片宽度

50 Da在0.64 ~ 1.45 1/k0的离子迁移率范围内积累100 ms或75 ms，周期时间分别为0.64 s和0.49 s。

原始文件处理

原始文件分析采用DIA-NN (10)Academic（2.0版）。通过提供人类FASTA文件和经常发现的污染物（17）（UP000005640_9606，分别于2025年3月6日下载），生成了DIA-NN计算机预测文库。对于小鼠肝脏分析，我们使用了之前所述的组织特异性文库（14）。精制小鼠肝脏文库包括68,006个前体、61,554个洗脱组和8225个蛋白质组。DIA-NN在默认模式下进行了微调。简而言之，前体错误发现率（FDR）为1%，前体电荷状态为2至4，前体m/z范围为300至1200，MS1和MS2精度为15.0 ppm，扫描窗口为0（由DIA-NN分配），MBR和蛋白质推断启用。氧化(M)和乙酰基（蛋白质- n-项）被包括为可变修饰，氨基甲基(C)被包括为固定修饰，每个肽最多允许两个修饰。对于使用diagonalPASEF获得的数据，我们提供了额外的选项-tims-scan。我们使用了该报告。统计和报告。DIA-NN的pg矩阵输出文件用于进一步的数据分析，全局蛋白质q值阈值为1%。

蛋白质组学数据分析

蛋白质组学数据分析使用Perseus(18)（版本1.6.50和2.1.2.0）和R环境（https://www.r-project.org/，版本4.4.3），使用以下软件包：ggplot2 (v3.5.1), dplyr (v1.1.4), tidyr (v1.3.1), stringr (v1.5.1), data。表(v1.17.0)。在线性空间中计算cv。

实验设计和统计学原理

对于每个蛋白质组比较，每个样本组至少使用3个重复。重复被定义为从同一组织切片中分离出的相邻区域，显示出与显微镜成像确定的相似的细胞类型组成。在图1所示的涉及小鼠肝脏和人类扁桃体的实验中，每种条件收集了6个重复，由组织大小和LC梯度的组合定义。MS法比较（图2），每个组织和方法采集8个重复，实验进行2次，共16个重复。在线性空间中计算变异系数（cv）。对于图3中的多组比较，其中检验了肿瘤、间质和浸润区样本，采用方差分析

基于排列的错误发现率（FDR）为5%。应用的统计学检验的详细方法见相应的图例。